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介紹免疫沉淀CHIP的實驗步驟
更新時間:2020-12-28 點擊次數(shù):3530次
 
  免疫沉淀CHIP的原理是:在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起,通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后,利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng),將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定,染色質(zhì)斷裂,染色質(zhì)免疫沉淀,交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),DNA的純化,以及DNA的鑒定。因為ChIP實驗涉及的步驟多,結(jié)果的重復(fù)性較低,所以對ChIP實驗過程的每一步都應(yīng)設(shè)計相應(yīng)的對照,而且對結(jié)果的分析也需要有一定的經(jīng)驗。對于剛剛開始使用ChIP技術(shù)的研究人員來說,使用成熟的商品化試劑盒和相關(guān)的技術(shù)服務(wù)會達(dá)到事半功倍的效果。
  一、細(xì)胞固定
  甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)-DNA,蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián),形成生物復(fù)合體,防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)是*可逆的,便于在后續(xù)步驟中對DNA和蛋白質(zhì)進行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%,交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時,具體時間根據(jù)實驗而定。值得注意的是,交聯(lián)時間如果過長,細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎,影響ChIP結(jié)果,而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短,則交聯(lián)不*,產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。
  二、染色質(zhì)斷裂
  交聯(lián)后的染色質(zhì)可被超聲波或MicrococcalNuclease切成400~600bp的片段(用瓊脂糖凝膠電泳檢測),以便暴露目標(biāo)蛋白,利于抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質(zhì),容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫,這都會引起蛋白質(zhì)變性,進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時,要在冰上進行,且要設(shè)計時斷時續(xù)的超聲程序,保證低溫。另外,超聲探頭要盡量深入管中,但不接觸管底或側(cè)壁,以免產(chǎn)生泡沫??偝晻r間也不要太長,以免蛋白降解。

滬公網(wǎng)安備 31011802001676號

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